【摘要】 目的探讨复方丹参在滋养细胞氧化应激中的保护作用。方法用不同浓度(0，1.25，2.50，12.50 mg/ml)的复方丹参对滋养细胞JEG-3进行预处理后，用5 mmol/L的过氧化氢(H2O2)诱导建立氧化应激模型。细胞的存活率、细胞内氧化应激水平、细胞裂解液中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性和mRNA表达分别用噻唑盐(MTT)法、活性氧(ROS)探针(DCFH-DA)法、化学比色和荧光定量RT-PCR检测。结果与未加丹参组(0mg/ml)比较，经复方丹参(1.25，2.50 mg/ml)预处理的滋养细胞，H2O2氧化损伤后,细胞的存活数明显升高，ROS产生及MDA含量明显减少，SOD活性及SOD-mRNA含量升高(P<0.01)。而高浓度组(12.50 mg/ml)细胞存活数下降，ROS、MDA、SOD及mRNA值均较低浓度组减少(P<0.01)。结论低浓度的复方丹参注射液对滋养细胞的氧化损伤有保护作用，可能通过上调SOD mRNA的转录及增强SOD酶活性起抗氧化作用。 【关键词】 复方丹参; 氧化应激; 滋养细胞 子痫前期(Preeclampsia,PE)严重威胁孕产妇和围生儿的健康和生命,其发病机制尚不清楚。目前观点认为PE是两阶段疾病，第1阶段胎盘浅植入-胎盘灌注减少,胎盘缺血、缺氧，局部出现氧化应激。胎盘局部的氧化应激通过多种机制引发母体血管内皮的损伤和炎症反应，导致第2阶段母体胎儿综合症的出现[1～3]。因此胎盘滋养细胞的氧化应激可能是PE发病机制中两阶段联系的首要因素[4]。从理论上来说，应用抗氧化剂对于该病的预防和治疗应有较好的效果。中药复方丹参注射液是丹参、降香两味中药经提取精制而成，其有效成分是丹参酮,它可扩张冠状动脉，抑制血小板聚集及直接清除氧自由基并能改善微循环而增加组织供血供氧，降香能行气祛瘀，被广泛应用于冠心病、心绞痛、心肌炎、肺心病、糖尿病等[5，6]的活血化瘀治疗。由于PE属“血瘀”的范畴,中医临床上常可采用活血化瘀的中药对其进行治疗。采用中药丹参治疗时通过改善母体内NO 、PGI2 、ET和TXA2 的病理状况,起到一定的血管舒张作用,用药后可使血压明显下降、症状明显减轻[7]。本实验采用滋养细胞来源的JEG-3 细胞在细胞水平上进行复方丹参抗氧化作用的基础研究，为临床治疗提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 细胞和试剂来源JEG-3细胞株购自北京协和细胞资源中心。复方丹参注射液由正大青春宝药业有限公司生产，批号为Z33020177,每支10 ml，每毫升含丹参和降香各1 g。RP1640培养基为Gibco公司产品，Trizol购自Invitrogen 公司。胎牛血清为天津TBD生产。MTT购自Sigma公司，蛋白裂解液、活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)及超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix 购自TOYOBO 公司，定量PCR 仪：ABI PRISM 7300 Sequence Detection System，定量PCR 反应体系为ABI公司产品，紫外/可见分光光度计LAMBDA 45为PerkinElmer 公司产品，全自动(荧光)酶标仪为TZCAN-SAFIRQ-2 奥地利TZCAN公司产品。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养JEG-3 细胞在含10 %胎牛血清的RP1640培养液37℃、5 % CO2条件下培养传代,初始接种密度为5×104 /cm2，待细胞融合时,将JEG-3细胞根据所加丹参终浓度分4组(以下复方丹参简称DS)：对照组、DS1、DS2、DS3，DS终浓度(参照文献[8，9])分别为0，1.25，2.50 mg/ml和12.50 mg/ml。将各组JEG-3细胞用含0.1%的牛血清白蛋白的RP1640培养基(不含血清)培养24 h，次日，加入5 mmol/L H2O2共孵育3h以诱导氧化应激[10]。然后以PBS洗3次以备后续分析。 1.2.2 MTT法检测细胞存活率将JEG-3细胞置96孔板经复方丹参和H2O2预处理后，向各组每孔内加入5 mg/ml的 MTT 20μl，置于37℃条件下孵育4 h，吸弃上清液，加入100μl二甲基亚砜，振荡数分钟，用全自动酶标仪(波长为490 nm)测定每孔OD值。 1.2.3 DCFH-DA法测细胞内ROS水平ROS检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内ROS的水平。本实验将JEG-3细胞置48孔培养板经DS和H2O2预处理后，实验当天，吸除培养液，PBS洗涤细胞后，无血清培养基稀释的终浓度为10μmol/L的DCFH-DA 在37 ℃、5 %CO2 条件下培养20 min，按ROS检测试剂盒说明用荧光酶标仪测荧光密度(FI)值。 1.2.4 MDA及SOD活性的检测将JEG-3细胞置25 cm2培养瓶经DS和H2O2预处理后，吸弃培养液，用碧云天生产的蛋白裂解液裂解细胞，收集裂解液，-70℃冻存待测。按试剂盒说明书操作，分光光度计及酶标仪检测。 1.2.5 SOD-mRNA (荧光定量RT-PCR)分析将JEG-3细胞置6孔板经DS及H2O2预处理后，吸弃培养液，收集细胞，加入1ml Trizol溶液，吹打混匀，使细胞充分裂解，收集裂解液， 采用Trizol 一步法抽提组织总RNA。取1μl RNA样品50倍稀释，在Beckman Coulter DU? 520UV/Vis Spectrophotometer 上测定OD 值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA 较纯,无蛋白质污染。取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5srRNA,18srRNA和28srRNA 条带，3条条带完整，即可证明总RNA抽提比较完整。取总RNA 1μg,根据试剂盒(Promega产品)提供方法以随机引物逆转录合成模板cDNA。定量PCR采用50μl ABI 体系,共进行40个循环,每个样重复3次。内参片段：18SrRNA-112bp，目的片段SOD: 201bp，设计的引物：qh-SOD-F2：5'CTCAGGAGACCATTGCAT，qh-SOD-R2：5' CAGCTAGCAGGATAACAGAT ,计算机软件分析各反应的荧光强度,参照标准曲线得出SOD-mRNA的相对值。 1.3 统计学处理用SPSS11统计软件进行分析，所有数据以±s表示，进行方差分析。 2.1 MTT法检测细胞的存活数如表1所示，复方丹参注射液(1.25，2.50 mg/ml)预处理的滋养细胞，H2O2氧化损伤后,与对照组 (0 mg/ml)比较，随丹参浓度增加，OD值呈上升，即细胞存活数增加。而高浓度丹参(12.50mg/ml)组与低浓度组比较，OD值下降低，各浓度组间差异有显著性(P<0.01)。 2.2 细胞内ROS水平的检测复方丹参注射液(1.25，2.50，12.5 mg/ml)预处理的滋养细胞，H2O2氧化损伤后，与对照组 (0 mg/ml)比较，随丹参浓度增加，FI值呈下降趋势，各浓度组间差异有显著性(P<0.01)。 2.3 MDA的检测如表1所示复方丹参注射液(1.25，2.50，12.50 mg/ml)预处理的滋养细胞，H2O2氧化损伤后,与对照组 (0mg/ml)比较，随丹参浓度增加，MDA值呈下降趋势，各浓度组间差异有显著性(P<0.01)。 2.4 SOD 活性及mRNA的水平如表1所示复方丹参注射液(1.25，2.50 mg/ml)预处理的滋养细胞，H2O2氧化损伤后,与对照组 (0 mg/ml)比较，随丹参浓度增加，SOD活性及mRNA值呈上升趋势，而高浓度(12.50 mg/ml)组SOD活性及mRNA值明显下降，各浓度组间差异有显著性(P<0.01)。SOD-RNA抽提电泳图及扩增曲线见图1～3。表1 各组细胞 ROS-FI、MTT-OD值及MDA含量及SOD活性及mRNA比较 3 讨论 研究滋养细胞功能的实验中，由于获得和培养胎盘原代滋养细胞比较困难，并且在分离和短期应用，细胞功能可发生一些潜在的变化，因此原代滋养细胞在实验中的应用受到了限制。人类滋养细胞来源的细胞系常用来研究滋养细胞的功能，现在常用于滋养细胞功能模型的细胞来源于恶性葡萄胎葡或绒癌的细胞，如JAR，JEG-3，BeWo。这些转化的细胞来源于滋养细胞，在细胞功能方面可提供许多有用的信息。本实验应用来源于人绒癌的滋养细胞系JEG-3，用H2O2建立氧化应激模型，探讨复方丹参的抗氧化作用。 氧化应激是指体内的氧化与抗氧化失衡，并倾向于氧化。当活性氧(ROS)的产生超过了抗氧化剂的防御能力，而导致细胞的损伤。本实验通过MTT法观察了不同药物浓度的复方丹参注射液对氧化损伤JEG-3细胞的保护作用。结果表明，低浓度丹参(1.25mg/ml和2.50mg/ml)在H2O2的损伤后，与不加丹参组比较，细胞存活数增加，具有保护作用，并呈现一定的浓度依赖性。但浓度过高(12.50 mg/ml)，细胞存活数减少，与任香善等[8，9]报道的高浓度丹参(12.50 mg/ml)对血管内皮细胞仍具有保护作用结果不一致，其原因尚待研究。 ROS包括H2O2、单线态氧(' O2)、超氧阴离子自由基(O2-·)及羟自由基(OH),其产生情况可反应细胞的氧化应激水平[10]。MDA含量可反映机体内脂质过氧化的程度，可作为估计细胞损伤程度的指标[8]。本实验结果表明，预先加入低浓度(1.25mg/ml和2.50mg/ml)的丹参可降低JEG-3的氧化应激水平，减轻氧化损伤。 SOD 是体内主要的自由基清除酶, 能清除超氧阴离子自由基, 保护细胞免受损伤,对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用[11]。本实验结果表明，预先加入适当浓度的丹参可以提高SOD的活性，上调SOD-mRNA的表达，增强了JEG-3细胞的抗氧化能力。但高浓度丹参组(12.50 mg/ml)SOD的活性及 SOD-mRNA的表达却下降，可能与存活的细胞数明显减少有关。 综上所述，适当浓度的复方丹参注射液对JEG-3细胞的氧化损伤具有保护作用，其抗氧化作用可能与SOD的活性及SOD-mRNA的表达增加有关。因此复方丹参在临床PE治疗中有一定的价值。 【参考文献】 [2] Redman CW，Sargent IL. 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